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PCR實驗室污染與防控

    在眾多的生物實驗室中,分子生物學檢測方法如PCR因其檢測靈敏度高、準確度好、操作方便、快速等優勢已經被廣泛應用。不過正是由于它的高靈敏性,實驗室中極微量的污染源都有可能導致檢測結果的假陽性,所以對環境中污染源的防控也極為重要。一旦出現實驗室環境污染,比如樣本之間交叉污染、試劑污染、儀器污染、陽性對照污染、PCR擴增產物污染、氣溶膠污染等,其中氣溶膠污染是一個非常重要而被忽視的污染源。實驗室出現氣溶膠污染,需要較長的時間進行根除。

一、污染原因

    1、樣本之間交叉污染。

    標本污染主要有收集標本的容器被污染;標本存放運輸時,由于密封不嚴或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;核酸模板在提取過程中,由于加樣槍污染導致標本間污染;手動提取核酸樣本時,污染的手套觸摸離心管內蓋導致的污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散,導致彼此間的污染。

    2、PCR試劑污染

    PCR試劑在配制過程中,移液槍、槍頭、離心管等原因造成試劑被PCR核酸模板污染。

    3、不同工作區域移液槍等耗材交叉使用。

    將易污染區域的移液槍、槍頭、離心管等耗材拿到潔凈區使用引起的污染;

    4、離心機轉子未定期擦拭。

    離心機通常進行各種試劑組分、不同盲樣的離心,如果離心管外部沾染病毒、陽性核酸或陽性質粒,容易造成污染。

    5、陽性對照造成的污染。

    開蓋時間過長高濃度質粒揮發到室內,陽性對照組分未使用完任意丟棄,加完陽性對照的槍頭未放入消毒液中。

    6、擴增產物開蓋造成的污染。

    這是PCR試驗中最主要、最常見的污染原因。因為PCR產物拷貝量大,遠遠高于PCR檢測拷貝的極限,PCR產物開蓋后,極易迅速造成擴散,極微量的PCR產物污染,就可形成假陽性。

    7、各個實驗室擦桌布、掃把,簸箕,工作服交叉使用。

二、PCR污染的監測

    一個正規的實驗室,要時刻注意監測實驗室的污染情況。了解實驗室有無污染,污染原因,污染程度,以便采取有效措施,防止和消除污染。一般通過陰陽性對照檢測污染情況。

    1、陰性對照:

    不將模板DNA或RNA加入到PCR試劑中,進行PCR擴增,對試劑是否污染進行監測。陰性水樣參與核酸提取和擴增監測整個試驗流程是否正規。

    2、陽性對照:

    PCR陽性對照對于被建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都是必需設有的, PCR反應是否成功,PCR陽性對照是一個重要的參考標志。

    如果陰性對照和陽性對照均成立,說明質量控制成立,實驗室未被污染,樣本檢測結果才有效。

    如果陰性對照不成立,出現擴增曲線,說明陰性對照被核酸污染,需要追溯污染源。

試劑污染

重新更換新拆封的合格試劑檢測,

如果陰性對照仍然有擴增曲線,初步判定為實驗室污染。

    實驗室污染

監控對象:實驗室內的儀器設備、空氣、物體表面

監測方法:1.1水樣驗證:每個實驗區放置10ml單蒸水水(敞口),1個小時后,取樣200ul。

1.2物體表面擦拭取樣:用棉拭子蘸取生理鹽水,在實驗室臺面(尤其是四周死角)、儀器表面和內孔涂抹取樣后放入約0.5mL生理鹽水中取樣。


三、解決PCR實驗室污染的方法


    (1)開窗通風:如在短時間內要消除實驗室污染,開窗通風促進實驗室內空氣流通,使停留在室內的核酸排放到室外。

    (2)紫外燈照射:將實驗室內生物安全柜內物品平鋪,打開離心機內蓋,然后將紫外等打開照射12-24小時,通風12小時以上。

    (3)消毒液降解核酸:及時用1%-2%的次氯酸鈉擦拭操作臺面和儀器,用10%次氯酸鈉浸泡試驗器具,同時用10%次氯酸鈉洗拖布擦拭地面。

    (4)高壓:試驗耗材、工作衣進行121℃30分鐘高壓。

    (5)使用商品化核酸去除劑噴灑室內降解核酸。

    (6)陽性污染特別嚴重,可以采取高錳酸鉀甲醛(2:1)過夜熏蒸實驗室。

四、PCR實驗室如何預防污染

    1、合理的實驗室分區


    2、實驗操作流程:

    (1)樣品制備區進行樣品處理,核酸提??;

    (2)配液區配置反應體系:酶混合液和PCR反應液混合,分裝至PCR反應管;

    (3)樣品制備區加樣:樣核酸和陰陽性對照加至反應液中;

    (4)PCR擴增區上機擴增檢測。務必保持單向操作流程,避免各區實驗室污染。

    3、各個實驗區內試驗用品專區專用

    配液區是最潔凈的試驗區域,樣品制備區的潔凈度稍差, PCR擴增區是最易被污染的區域,各區之間試驗物品專區專用,避免因交叉使用造成實驗室污染。

             4、試驗操作要規范

    (1)正確使用移液槍,保證試劑配比計量正確,同時避免液體吸入移液槍口造成污染。

    (2)實驗的過程中應勤換手套,在進出不同區域或進行模板操作后,都應及時更換手套。

    (3)試劑盒各組分在打開之前應先做瞬時離心(約10s),將管壁及管蓋上的液體甩至管底部,從而減少污染手套或加樣器的機會。開管動作要輕,以防管內液體濺出或形成氣溶膠,造成污染。

    (4)樣本量較多時,應將反應液預混,再分裝至PCR反應管,最后添加核酸模板,以減少單個添加操作繁瑣造成的污染。

    (5)每次試驗必須設定陰性對照和陽性對照,讀取結果時,在保證陰陽性對照均成立的情況下,判讀樣本結果才有效。

    (6)實驗結束后,PCR反應管嚴禁打開,及時放置次氯酸鈉消毒液中浸泡。

    5、做好日常消毒工作

    每日工作完成后,及時處理實驗室內廢棄物,消毒液擦拭操作臺面和儀器,拖布蘸取消毒液擦拭地面,開窗同風10分鐘以上。

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